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截短钙网蛋白融合FMDV VP1及PCV2 Cap蛋白表达形成多聚体的免疫原性分析

论文编号:lw202002222218051426 所属栏目:职称论文发表 发布日期:2020年02月26日 论文作者:无忧论文网

本文是一篇职称论文发表,本研究将采用遗传背景清晰,操作简便产量高大肠杆菌表达系统,但是由于缺少翻译后的修饰作用,常会收到包涵体的限制,本试验也将力求实现了 Cap 蛋白的可溶性表达,为后期疫苗的制备奠定基础。同时,采用前期分离培养的 PCV2 DF-1 毒株对试验动物进行攻毒保护试验,验证制备的 Cap-CRT 融合蛋白能否有效保护机体。


第一篇文献综述


第 1 章FMDV的研究进展

1.1   FMD 简介

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)为高度接触性传染病,主要易感牛、猪、山羊、绵羊等偶蹄动物[1]。主要发病症状为发热、食欲不振,口、舌、鼻盘、乳房及蹄部等出现水泡样病变[2]。疾病急性感染期间,病畜会出现严重的病发症状,但通常并不致死,然而其生长速率、产奶量及动物和动物制品交易都会受到严重影响。许多国家都会参考世界动物健康组织(OIE)发布的《陆生动物卫生法典》(OIE,2014)的建议,限制来自FMD流行地区的易感动物及其产品贸易,这些地区主要以发展中国家为主,严重影响了这些国家的经济和发展。19世纪50年代以来,许多国家开始实施的疫苗接种政策,包括北美、西欧和亚洲部分地区做到了FMD的彻底清除。然而,反复爆发的疫情逐渐提高了人们对该疾病带来的经济和社会危害的认识。未发生过FMD的国家首次爆发,彻底清除和防控该疾病带来的巨大费用以及农业生产和贸易收入的损失,都会造成数十亿美元的损失[3]。

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)是造成FMD的主要病原体,存在七种不同的血清型(O、A、C、Asia-1和南非(SAT)1-3型),由于病毒的高突变率还会产生各种亚型。由于存在恒定的抗原漂移,FMDV感染一种特定血清型或者亚型治愈后通常缺乏有效的交叉保护。FMD在非洲和亚洲的大部分地区流行,欧洲、北美和澳大利亚通过严格控制动物和农产品的进口可以保持其在不接种疫苗的情况下依然保持无病毒状态。近年来,中国通过开展广泛的疫苗接种并进行抗体水平监测,为控制FMD投入了大量资源,从而推动了彻底清除FMD疫情的道路。

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1.2   FMDV 的病原学 

FMDV 为小 RNA 病毒科口疮病毒属的代表性成员。基因组为单股正链 RNA,包埋于无囊膜的正 20 面体的病毒颗粒中,粒子直径大约为 25-30nm[1]。FMDV基因组全长约由 8500 个核苷酸组成,有且只有一个开放阅读框(ORF),两侧为5’和 3’非编码区(UTR)(图 1-1)。5’ UTR 被分为几个特定的功能区域,这些区域与病毒复制和翻译相关。病毒 m RNA 的翻译从 5’ UTR IRES 下游的两种 AUG起始密码子开始,生成长度约为 2300 个氨基酸(aa)的多聚蛋白前体,进而被蛋白酶进行切割处理(图 1-1)。病毒翻译后的第一个成熟产物为 Lpro,具有木瓜蛋白酶的性质,并且是病毒毒力相关的重要成员[4]。所有加工成熟的产物形成一个由 60 个单元体组成的衣壳。每个单元体包含 P1 基因编码的 4 种结构蛋白 VP4、VP2、VP3 和 VP1(也做 1A、1B、1C 和 1D)[5]。所有血清型的 FMDV 中最重要的抗原点都在 VP1(1D)中的 G-H 环上。由于该环的高变性,会造成不同血清型之间没有交叉保护,阻碍了疫苗的发展[6]。P2 和 P3 基因主要编码非结构蛋白,包括 2A、2B、3A、3 个重复的 3B(VPg),3Cpro 和 3Dpro。3Cpro 为病毒编码的半胱氨酸蛋白酶,参与 P1、P2 和 P3 的蛋白裂解,产生成熟的裂解产物[7]。3Dpro 是一种 RNA 依赖的聚合酶,影响病毒的多样性。ORF 末尾的 3’ UTR 相对较短,由两个茎环和一个 poly  A 束组成,这两者都是病毒感染所必需的,并且已知都能激活 IRES[8]。

图 1-1   FMDV 基因组

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第 2 章   PCV2  的研究进展


2.1   PCV2  简介

当前,猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus virus type 2,PCV2)被认为是引发猪圆环病毒相关疾病(Porcine circovirus virus association disease,PCVAD)最主要的病原体,其给世界范围内生猪产业带来了严重的经济损失,其中也包括中国。自 1998 年传入中国以来,引发了政府相关部门,生猪养殖企业,农场主以及兽医相关工作人员的高度重视。中国的学者也不断进行了 PCV2 的分子流行病学调查及分析,成功分离鉴定了流行的 PCV2 基因型,并制备了很多 PCV2 病毒样粒子进行新型流行病学预防模式。自 2009 年,商品化 PCV2 疫苗,包括亚单位疫苗以及灭活疫苗,在猪场中都已广泛应用。

近期在美国已经免疫过 PCV2 疫苗的猪场出现了一种新的 PCV2 相关疾病被称为急性肺水肿,该病与其他 PCVAD不同。北美,欧洲以及亚洲的一些国家进行的临床及实验室研究都证实了现行的商业化疫苗(基于 PCV2a 亚型)在抵御 PCV2 的感染上是有效的,具体也包括PMWS 的一些共感染的症状,包括淋巴组织的严重损伤,PCV2 相关病毒血症,以及一些微观可见的严重损伤。然而,由于后续的疫苗带来的选择压力,多地猪场也都出现了新的突变毒株及基因型(例如 PCV1/2 以及 PCV2d)。

近几年来,由于 PCVAD 带来的持续不断的经济损失,国内外政府鼓励科研工作人员参与到 PCV2 的分子流行病学及疫苗学的相关研究。持续跟进中国PCV2 的防控情况,对于掌握该疾病的分子流行病学,诊断控制措施,以及开发新型疫苗都是非常有意义的。

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2.2   PCV2  病原学

猪圆环病毒(PCVs),是已知的最小的动物病毒,包括 PCV1 和 PCV2 两个血清型,属于圆环病毒科圆环病毒属成员。PCV1 于 1974 年被首次发现以污染物的形式存在于猪肾细胞系 PK15(ATCC CCL-33)当中,但是鉴定出其没有致病性[71]。但是从患有 PMWS 的猪中分离得到的 PCV2 已经超过 20 年了。

PCV1 的基因组包含 1759 个核苷酸(bp),而 PCV2 则有 1767 或者 1768 个。PCV2 基因组包含 3 个开放阅读框(ORFs),ORF1(945 bp),位于 51-995 bp;ORF2(702/705  bp,位于 1734/1735-1030/1033/1034  bp);ORF3(315  bp,位于671-357 bp)(图 2-1)[72]。分别编码具有免疫原性的衣壳蛋白以及病毒致病性相关蛋白[73]。近期也有研究指出发现了新的病毒蛋白 ORF4(180 bp,位于 386-565 bp),该蛋白不会影响 PCV2 病毒复制,但是能够抑制天冬氨酸的活性并在感染病毒时起到调节 CD4(+)以及 CD8(+)T 淋巴细胞的作用[74]。

图 2-1   不同 PCV 的进化树分析

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第 3 章   VP1-CRT 融合蛋白(rC4V)抗体间接 ELISA 检测方法的 建立 .............................. 73

3.1   试剂及血清 ................................... 73

3.2   试验方法............................... 74

第 4 章   PCV2 Cap-CRT 融合蛋白的制备和免疫原性分析 .......... 85

4.1   试验材料............................. 86

4.2   试验方法.................................... 87


第 3 章   CRT 的研究进展


3.1   CRT  简介

钙网蛋白(Calreticulin,CRT)是一种长度为 46 kDa 的真核细胞内质网上的Ca2+结合糖蛋白[115]。该蛋白由 3 个区域组成,包括凝集素样球状蛋白 N 区域(18-197 aa),脯氨酸富集区 P 区域(198-308 aa)以及 Ca2+结合的 C 区域(309-412 aa)[116]。CRT 也可以存在于多种不同细胞表面,并表现出不同的生物学功能。近期的研究结果显示可溶性的 CRT 可以从风湿病的患者以及从患有系统性红斑狼疮(SLE)的患者血清当中分离得到,而人源或者鼠源的天然 CRT(nCRT)可以在体外直接激活巨噬细胞[117]。

此外,r CRT/39-272,原核表达了鼠源 CRT 片段(39-272  aa),并在其 N 端融合了 His 标签,在体外具有强烈的 B 细胞及巨噬细胞激活能力,并能够在小鼠体内诱导特异性抗体的产生[118]。该重组的多聚蛋白也展示出了潜在的佐剂性质,无论是否存在 T 细胞的辅助作用条件下,都能够有效的产生针对与 CRT 融合表达的目标抗原的 IgG。但是针对该现象的分子机制并不清楚。Kozlov 等人