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玉叶金花化学成分及抗炎活性药学研究

日期:2020年02月22日 编辑:ad201107111759308692 作者:无忧论文网 点击次数:445
论文价格:150元 论文编号:lw202002202332592019 论文字数:0 所属栏目:药学论文
论文地区:中国 论文语种:中文 论文用途:硕士毕业论文 Master Thesis

本文是一篇药学论文,笔者认为玉叶金花作为我国一项传统中药,在我国使用时间悠久,同时分布广泛、资源丰富,国内外学者对玉叶金花的化学成分和药理活性做了研究和报道,证明了玉叶金花水提物具有显著的抗炎、抗菌、镇痛、抗胆碱、抗生育的作用,但是目前对于玉叶金花具体的化学成分的药用机制及药理作用机制研究较少,有待进一步探索研究。


第一章  玉叶金花中化学成分的研究


1.1 实验材料、仪器及试剂

1.1.1  原料药材及药材鉴定

玉叶金花由桂林三金药业股份有限公司提供,经广西食品药品检验所中药室黄清泉主管药师鉴定为茜草科植物玉叶金花 Mussaenda Pubescens Ait. f.的干燥根和茎。

1.1.2 实验仪器

UPLC-MS(Bruker,美国),核磁仪(Varian VNMRS 600MHz,美国),旋转蒸发仪(Heidolph,德国),分析天平(梅特勒百万分之一,瑞士),制备液相 GX-271(吉尔森,法国),高效液相色谱仪(安捷伦,1260)。

1.1.3 试剂与材料 

色谱柱:Luna  C18、YMC-Pack  C8、SunFire  C18;硅胶(200~300目,国药集团化学试剂有限公司),硅胶 G 板、硅胶 GF254(青岛海洋化工有限公司),MCI(三菱化学 MCI GEL CHP20P 聚苯乙烯型反向树脂填料),大孔树脂 D101,Sephadex  LH-20(GE  Healthcare,  美国),95%工业乙醇,95%乙醇,石油醚(60-90℃),乙酸乙酯,二氯甲烷,氯仿,丙酮,甲醇,乙腈等试剂(国药集团化学试剂有限公司,分析纯),甲醇、乙腈(色谱纯)。

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1.2 玉叶金花化学成分的提取与分离

1.2.1  提取分离过程

称取玉叶金花药材粗粉 6.7kg,用 10 倍体积 95%工业乙醇加热回流提取 3 次,每次回流 1h,合并提取液,回收乙醇至无醇味。玉叶金花浸膏加水溶解稀释至 4L,分别用石油醚(60~90°)、乙酸乙酯萃取,回收有机试剂,得石油醚部位(113.0g)和乙酸乙酯部位(120.0g)。乙酸乙酯部位进行进一步分离。

乙酸乙酯部位通过硅胶拌样,反复过硅胶柱,以二氯甲烷和甲醇为洗脱剂,梯度洗脱,得 8:1 部位Ⅰ(7.09g)和 4:1:3ml 部位Ⅱ(15.90g)进一步分离。部位Ⅰ硅胶拌样,硅胶柱洗脱,洗脱剂三氯甲烷和甲醇,10:1 洗脱部位进一步 Sephadex LH-20 分离,以二氯甲烷:甲醇(1:1)洗脱,合并相同化合物,进一步通过 Sunfire 半制备柱 C18 制备得到化合物1(9.70mg).  部位Ⅱ上样于 MCI 柱,甲醇水系统洗脱,得Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3。Ⅱ1 部位经 GX-271 制备液相、制备柱 Lunna C18 5μm 制备得到Ⅱ1A化合物 2(15.90mg)、Ⅱ1B、Ⅱ1C,Ⅱ1B 制备液相再次制备得到化合物 1(47.15mg)、化合物 3(14.00mg)、化合物 4(4.80mg)、化合物5(26.80mg);Ⅱ1C 半制备 YMC-Pack C8 柱制备得到化合物 6(30.00mg)。Ⅱ2 通过 X﹒Bridge  C18  色谱柱制备得到化合物 7(34.00mg)、化合物8(15.10mg)、化合物 9(117.00mg)。Ⅱ3 部位先以甲醇水系统进行ODS 柱分离,再经过 Sephadex LH-20 柱分离,最后通过制备液相制备得到化合物 15(232.00mg)和化合物 10(16.54mg)。

因在对乙酸乙酯部位化合物分离过程中发现咖啡酰奎宁酸类化合物发生甲基化,通过 LC-MS 化合物追源发现玉叶金花醇提物中未甲基化的咖啡酰奎宁酸类成分含量较多,故对玉叶金花进行 95%工业乙醇提取分离。玉叶金花乙醇提液,回收乙醇,用 80%乙醇静置 12h,滤过,滤液减压至无醇味,加水稀释 1:1,静置 12h 滤过;提取液大孔树脂 D101 吸附,
依次用水、15%乙醇、45%乙醇、95%乙醇洗脱。15%乙醇部位依次经过MCI 柱,Sephadex LH-20 柱,得到化合物 11(38.90mg);45%乙醇部位甲醇水系统 MCI 色谱柱洗脱,制备液相制备,Sephadex LH-20 柱纯化,得到化合物 12(4.60mg)、化合物 13(24.00mg)、化合物 14(89.00mg)。

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第二章  玉叶金花中 4 种有机酸类化合物的含量测定


2.1 实验试药、试剂和仪器

2.1.1 试药、试剂

玉叶金花(经广西食品药品检验所中药室黄清泉主管药师鉴定为茜草科植物玉叶金花 Mussaenda Pubescens Ait. f.的干燥茎和根),对照品绿原酸(中国食品药品检定研究院,110753-201716,110753-201415,纯度>96.6%)、异绿原酸 A(中国食品药品检定研究院,111782-20170,纯度 >97.3% ) , 异 绿 原 酸 B ( 上 海 安 谱 实 验 科 技 股 份 有 限 公 司 ,CDAA-280180,纯度>98.6%),异绿原酸 C(中国食品药品检定研究院,11884-201102,纯度>94.1%);乙腈为色谱级,甲醇、磷酸为分析纯,水为高纯水。

2.1.2 仪器

Agilent 1260 infinity 高效液相色谱仪(VWD 检测器、四元恒流泵、在线脱气机、自动进样器,美国安捷伦公司);Agilent 1100 型液相色谱仪(DAD 检测器、四元恒流泵、在线脱气机、自动进样器,美国安捷伦);百万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多);十万分之一电子天平(瑞士梅特勒-托利多);双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

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2.2 外标法测定玉叶金花中绿原酸含量

2.2.1 方法与结果

2.2.1.1 色谱条件

色谱柱 SHISEIDO C18 MGⅡ(5μm,4.6mmL.D.×250mm);柱温30℃;流速:1.0mL/min;流动相:乙腈:0.4%磷酸(9:91)[19];检测波长:327nm。理论塔板数 31883。液相图如图 15。

图 15:玉叶金花样品及对照品 HPLC

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第三章  玉叶金花中 4 种有机酸类化合物的抗炎活性研究 ...................... 63

3.1  实验材料与仪器 ................................... 63

3.1.1  实验材料 ..................................... 63

3.1.2  实验仪器 .................................. 63

第四章  讨论 ...................... 73


第三章  玉叶金花中 4 种有机酸类化合物的抗炎活性研究


3.1  实验材料与仪器

3.1.1  实验材料

小鼠 RAW246.7 细胞(由广西中医药大学杨世林团队提供),绿原酸(中国食品药品检定研究,纯度>96.6%)、异绿原酸 A(中国食品药品检定研究院,纯度>97.3%),异绿原酸 B(上海安谱实验科技股份有限公司,纯度>98.6%),异绿原酸 C(中国食品药品检定研究院,纯度>94.1%),培养基(GIBCO,美国),胎牛血清(GIBCO,,美国),LPS(SIGMA,  067M4006V,美国),MTT(SIGMA,  MKCB8895,  纯度>97.5%,美国),Griess 试剂(SIGMA,美国),EILSA 试剂盒(欣博盛生物科技有限公司),培养瓶(Thermo,美国),离心管,细胞刮,96 孔板,24 孔板,移液管,枪头(10μL, 300μL, 1mL),注射器,微孔滤膜,一次性滴管。

3.1.2  实验仪器

各规格移液枪(艾本德,德国),酶标仪(BioTek,德国),倒置显微镜(OLYMPUS,日本),超净台(ATRTECH,日本),离心机(湘仪,湖南),培养箱(Thermo,  美国),冰箱(-20°,-80°),水浴锅,灭菌锅。

表 45   LPS 诱导 RAW246.7 细胞 NO 的释放(mean±sd, n=3)

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第四章  讨论


1、通过采用硅胶色谱柱、MCI 色谱柱、葡聚糖凝胶色谱柱、制备液相等分离技术方法从玉叶金花中分离得到 15 个化合物,鉴定其中 14 个化合物的结构,分别为山栀子苷甲酯(shanzhiside methyl ester)(1);schimoside(2),mussaendiside L(3),隐绿原酸甲酯(4-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(4),绿原酸甲酯(3-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(5),玉叶金花苷酸甲酯(mussaenoside)(6),异绿原酸 B 甲酯(3,4-dicaffeoylquinic  acid  methyl  ester)(7),为异绿原酸 A 甲酯(3,5-dicaffeoylquinic  acid  methyl  ester)(8),异绿原酸 C

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