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富白细胞-血小板纤维蛋白对软组织愈合及炎症调节的医学研究

论文编号:lw202002222210182369 所属栏目:医学论文发表 发布日期:2020年02月24日 论文作者:无忧论文网

本文是一篇医学论文发表,本研究拟探讨 PRF 对软组织愈合及炎症调节的影响,为促进口腔种植体周围软组织愈合提供理论依据。


第 1 章  引言


1.1 富血小板纤维蛋白促进软组织愈合的研究进展

1.1.1 概述

目前,在开发能够调节炎症因子、提高组织愈合速度的生物添加剂方面,临床研究仍面临着重重困难。虽然早在 30 多年前就对纤维蛋白类物质的应用进行了解释[6],但由于制备工艺复杂,且存在交叉感染的风险,其使用仍存在争议。

PRP 的制备是通过二次离心得到。第一次离心将红细胞从血浆和白细胞层中分离出来。在之后的第二次离心过程中,血小板会从无血小板血浆中分离出来,产生 PRP,这种血小板浓缩物,其生长因子浓度是全血的 6 - 8 倍[10]。这些血小板被证明能缓慢分泌高浓度的生物活性物质,并慢慢扩散入周围的微环境,促进组织再生[11-15]。大量研究[11, 16, 17] 表明,PRP 可进一步促进软组织或硬组织的外科伤口愈合。Whitman 等人开发了商业化的 PRP[16],他们是第一批尝试在口腔外科手术中应用 PRP 的研究者。在研究中他们发现,不论是在宿主骨还是在移植骨材料中,成骨细胞都有被激活的现象。然而,这个过程存在多种风险,使用牛凝血酶制备的 PRP,产生的相关抗体可能对患者造成潜在的生命危险,同时,抗凝因子的使用可能延迟伤口的正常愈合,这些问题使其应用受到限制。2000 年,法国科学家提出了新一代血小板浓缩物的概念,并将这种新产品命名为 L-PRF[5]。L-PRF 内富含大量的血小板,血小板内含有许多重要的生长因子,可促进细胞增殖、胶原生成、白细胞趋化、血管生成和细胞分化。同时,L-PRF 还富含大量的白细胞,这些白细胞在创口愈合过程起到重要作用[13,  18-22]。此外,L-PRF 含有增强骨改建的三种粘附分子(纤维蛋白、纤连蛋白和维甲酸)。抗凝剂的加入诱导了 PRP 的聚合,但 L-PRF 的聚合是一个自然而缓慢的过程。因此,L-PRF 具有更适合细胞因子和生长因子储存以及细胞迁移的纤维蛋白网络结构[23, 24],如图 1.2。

如图 1.2 在 PRF 中发现的细胞类型、细胞外基质成分和生物活性分子

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1.2  牙龈成纤维细胞在口腔软组织愈合的重要性

成纤维细胞是间充质来源的细胞,大部分间质结缔组织内的细胞外基质都由他们产生,其还对伤口的愈合和修复有着重要的作用。关于这种细胞类型的功能,我们所知的大部分都来自于对胚胎真皮成纤维细胞及其衍生细胞系的研究。然而,越来越多的证据表明,不同组织来源的成纤维细胞在基因表达、生长、运动和其他特性方面有着众多的不同之处[66]。牙龈和黏骨膜成纤维细胞与头部其他成纤维细胞类似,其特殊之处在于,它们是在发育过程中由神经嵴衍生的“外胚层”产生的,而不是像其他大多数成纤维细胞一样,由中胚层产生。虽然牙龈和黏骨膜成纤维细胞与其他成纤维细胞有许多共同之处,但从它们特殊的发育来源和位置来看,我们可以猜测,它们对创伤刺激具有有独特的反应,以便在口腔环境中应付外在变化。

在伤口愈合这一过程中,成纤维细胞最重要的功能就是产生新的细胞外基质来修复受损组织。然而,必须一提的是,健康结缔组织中的成纤维细胞是处于“休眠”状态中的,具有非常低的有丝分裂和生物合成活性。为了产生大量新的细胞外基质,它们需要被“激活”,这意味着它们必须能够感知和响应外部刺激。直到最近 20 年,我们才意识到,成纤维细胞它还具有就监测结缔组织内环境平衡的重要作用,是机体内的  “前哨”  。  成纤维细胞存在于许多组织中,是第一个对组织损伤或细菌感染起反应的细胞(图 1)。在急性创伤中,血液会渗漏进入组织间质,聚集的血小板释放生长因子和趋化因子,不仅会吸引免疫细胞,也会直接刺激此处的成纤维细胞产生和分泌更多的趋化因子,尤其 IL-6 和 IL-8,并在损伤部位召集中性粒细胞[67]。当感染时,脂多糖和其他细菌产物会再次诱导成纤维细胞产生 IL-6、IL-8 和其他趋化因子。

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第 2 章  细胞培养及体外炎症模型的建立


2.1 实验材料与设备

倒置显微镜(CKX41 型,日本 olympus 株式会社),; 二氧化碳培养箱(HF212UV 型,上海力申科学仪器有限公司); 超净台(VS-1300U 型,苏州净化设备有限公司); 离心机(5810R 型,德国 eppendof 有限公司); 酶标仪(SUNRISE 型,奥地利 team 有限公司); MTT(德国 sigma 有限公司); DMEM 培养基(美国 gibco 有限公司); 胰蛋白酶(美国 gibco 有限公司); 胎牛血清(美国 hyclone 有限公司); 分散酶(德国 sigma 有限公司); 1000IU/ml 青霉素&1000g/ml 链霉素(美国 hyclone 有限公司); 牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P. gingivalis -LPS,美国 invivogen 有限公司);GeneJET RNA 纯化试剂盒(#K0731, #K0732,德国 thermo fisher scientific 有限公司); Trizol(日本 takara 株式会社),  ; 特殊反应试剂盒(日本 takara 株式会社); 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8,日本 dojindo 株式会社); 采血管。

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2.2  实验方法

2.2.1 人牙龈成纤维细胞系的建立

(1)我们从种植术后患者口腔内取到牙龈组织块(准入及排除标准同第五章临床试验),先用含 10%双抗的 DMEM 培养基冲洗组织块,再用含 10%双抗的 PBS 清洗。

(2)将清洗过的牙龈组织块放入 50 毫升含有消化酶的离心管内,在 4℃条件下浸泡 12 小时。

(3)将组织样本移至 100mm 的培养皿盖子上,用无菌镊子和剪刀去除组织块表面的上皮层,将其切成约 0.5mm3大小。

(4)将小块(0.5mm3)组织放进培养瓶,加入含 15%胎牛血清和 1%抗生素的高糖 DMEM 培养基。注意:需要先把培养瓶倒置放进孵箱,使组织块在靠上方的瓶底侧贴壁。2h 后,我们再把培养瓶颠倒回正常的方向,放回 CO2 恒温培养箱中,在 37℃、5%CO2 饱和湿度条件下静置培养。(图 2.1 A 和 B)。

图 2.1 成纤维细胞培养方案

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第 3 章  富白细胞-血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞增殖及炎症因子释放的影响..................................... 20

3.1 实验材料与设备 ................................ 20

3.2.1 富白细胞-血小板纤维蛋白制备方案(L-PRF) ..................... 21

3.2.2 L-PRF 扫描电镜  (SEM) ............................ 22 

第 4 章   富白细胞-血小板纤维蛋白对组织愈合的影响体内实验 .... 37

4.1 实验材料与设备 .................................. 37

4.1.1 主要实验设备 ....................................... 37

4.1.2  主要实验试剂及材料 ................................... 38

第 5 章:富白细胞血小板纤维蛋白(L-PRF)对种植体周围软组织愈合及术后炎症控制的影响:随机临床研究 ............ 49

5.1  实验器材与材料 ............................... 50

5.1.1 材料和试剂 .................................... 50

5.1.2  设备与器械 ............................... 50


第 4 章   富白细胞-血小板纤维蛋白对组织愈合的影响体内实验


4.1 实验材料与设备

4.1.1 主要实验设备

高速离心机(80-2 型,常州市江南实验仪器有限公司); 种植机(CHIROPRO 980 型,瑞士 bien air 有限公司); 枪型钻(Box 5190 型瑞典 nobel biocare AB 有限公司); 电动吸引器(7A-23D 型,江苏省鱼跃医疗设备股份有限公司); 分析天平(Precisa XB 220A 型); 温度磁力搅拌器(IKA C-MAG HS-7 S25); 电动热恒温培养箱(HG303-3 型,南京实验仪器厂); 轮式切片机(RM2245 型,  德国 leica 有限公司); 组织包埋机(BMJ-B 型,常州市中威电子仪器有限公司); 包埋冷台(BMJ-B 型,常州市中威电子仪器有限公司); 恒温摊片烤片机(TK-218 型,泰维科技实业有限公司); 超纯水系统(CCT-3300 型,中国和泰); 精密鼓风干燥箱(BPG-9140A 型,上海一恒科学仪器有限公司); 立式压力蒸汽灭菌器(SN310C 型,重庆雅马拓科技有限公司);显微镜(BX51TF 型,日本 olympus 株式会社)。

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第 5 章:富白细胞血小板纤维蛋白(L-PRF)对种植体周围软组织愈合及术后炎症控制的影响:随机